• Connaître les principes de réalisation, transmission et utilisation des prélèvements à visée sanitaire et de recherche
• Connaître les modalités de transmission de ces prélèvements au laboratoire d'anatomie et cytologie pathologiques
• Connaître les principes de base de réalisation des techniques morphologiques suivantes : cytologie, histologie, immunohistochimie, hybridation in situ
• Connaître les principes permettant de réaliser des techniques de biologie moléculaire non morphologique sur les prélèvements tissulaires / cellulaires, ainsi que leurs principales indications
• Connaître les principales indications de l'examen extemporané, son principe de réalisation et ses limites
• Connaître les exigences nécessaires pour l'utilisation des prélèvements dans des travaux de recherche

Généralités

Définition

Anatomo-pathologie: étude des lésions provoquées par les pathologies sur les organes, les tissus ou les cellules / elle présente un intérêt diagnostique, pronostique, & d'évaluation d'efficacité des traitement

Examens à toujours corréler avec les données cliniques

Prélèvements

Types: liquide, frottis, produits de ponctions à l'aiguille, biopsies, pièces opératoires

• Cellulaires pour examen cytologique : liquides de ponction / autre liquides (urines, lavage broncho-alvéolaire) / myélogramme / cytoponction / frottis cervico-utérin / apposition sur lame (d'une biopsie ostéo-médullaire..)
• Tissulaires pour examen histologique : biopsies (Numéroter pièces si biopsie multiple : prostate..) / pièce opératoire (dont examen extemporané) / autopsie

Modalités de prélèvement

• Réalisés par médecins selon recommandations et respect des contre-indications
• Quasiment tout tissu prélevé fait l'objet d'un examen anatomopathologique, parfois à titre systématique
• Autres analyses possibles : parasito-mycologie (lavage broncho-alvéolaire..) / biologie moléculaire (fragment de biopsie ganglionnaire)
• Toujours préciser sur le prélèvement le type d'analyse souhaité

Modalités de transmission et d'envoi

Etape essentielle pour bonne réception et bonne qualité de l'analyse

Prélèvement toujours accompagné de demande / chaque prélèvement est identifié, étiqueté, numéroté / si besoin consentement du patient joint pour conservation

Prélèvements adressés avec identification du patient + feuille de demande d'examen anatomopathologique précisant

• Identifiants du patient / adresse du patient et/ou service d'hospitalisation
• Nom du médecin préleveur, coordonnées / caractère urgent éventuel
• Nature du prélèvement / siège du ou des échantillons / date et heure du prélèvement / renseignements cliniques pertinents, aspect macroscopique des lésions / recherches particulières demandées

En général envoyé fixé pour empêcher l'autolyse du tissu (formol dilué)

• Fixation réalisée par l'anatomopathologiste / le prélèvement est envoyé directement congelé sinon
• Sinon envoyer le + rapidement possible pour éviter autolyse/dessiccation
• Indications à ne pas fixer le prélèvement : demande d'examen extemporané / demande de recherche de graisses dans le tissu (car la paraffine dissout les graisses) / demande d'examen d'immunofluorescence directe (biopsie rénale, typage d'amylose…) / tumeur pédiatrique, suspicion de lymphome, sarcome (on réalise la congélation avant la fixation)

Selon le type de prélèvement

• Liquide de ponction : conservation dans un tube sec / transmission tel quel (centrifugé sur lame au laboratoire)
• Etalements (myélogramme..) : étalement sur lame immédiat par préleveur, séchage à l'air, identification de la lame, transmission (plaquettes de protection)
• Frottis cervico-utérin : en phase liquide, cellules conservées en milieu liquide (permet test HPV) / en milieu conventionnel : cellules étalées sur lame d'emblée
• Biopsies : carotte de biopsie fixée par l'alcool pour diagnostic morphologique / formol pour diagnostic morphologique et moléculaire / congelé ou conservé dans RNA-later pour certaines analyses moléculaires (immuno-histochimie, PCR)

Techniques de base en anatomie et cytologie pathologiques

Cytologie

• Fixation/mise sur support (lame) / coloration
• Mise sur support : directement étalées sur lames ou cyto-centrifugation ou étalement (frottis)
• Etalement en monocouche : recueil des cellules sur liquide de préservation / cellules remises en suspension, concentrées et transférées sur lame en une couche
• Fixation : par dessiccation rapide (à l'air) ou par immersion dans alcool ou par pulvérisation d'une laque
• Lames colorées puis examinées / technique très rapide
• Souvent simple orientation diagnostique ou dépistage

Histologie

• Fixation/ éventuelle dissection avec choix des prélèvements pour pièce volumineuse / imprégnation et inclusion en paraffine, obtention du bloc de paraffine / coupe du bloc (microtome) et mise sur lame de la coupe / déparaffinage et coloration de la coupe (hématéine-éosine, …)
• Prend ≈ 1 jour (rajouter 1 jour si dissection à réaliser) / parfois résultats possibles le jour même en cas d'urgence
• Si nécessité d'un résultat en extrême urgence › examen extemporané

Immuno-histochimie / cytochimie (protéines)

• Permettent identification & localisation de protéines sur préparation histologique ou cytologique (via propriétés antigéniques)
• Effectuées sur lames non colorées (après déparaffinage éventuel)
• Formation d'un complexe antigène-anticorps : zone fluorescente si anticorps lié à un fluorochrome ou zone colorée si anticorps lié à une enzyme révélée par une méthode histo-enzymatique
• Immunofluorescence directe : anticorps purifié directement couplé avec molécule de fluorochrome / surtout utilisé pour mise en évidence de dépôts tissulaires d'immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et biopsies rénales congelées (microscope à fluorescence)
• Immunofluorescence indirecte : anticorps primaire révélé par 2e anticorps couplé à une enzyme

Hybridation in situ (ADN-ARN)

• Permet identification de séquence d'acide nucléique (ARN, ADN) dans des cellules d'une préparation histologique ou cytologique
• Sondes nucléiques couplées à traceurs, soit un fluorochrome (FISH) ou soit une enzyme (CISH) (et mêmes méthodes de révélation qu'en immunohistochimie : via microscopie optique pour FISH, coloration pour CISH)

Interprétation des images et comptes-rendus

Lames examinées au microscope par médecin anatomopathologiste (± autres techniques : colorations, immuno-histologie, biologie moléculaire…)

Analyse anatomopathologique selon interprétation d'images, souvent selon le contexte clinique

Terminologie codifiée utilisée dans les comptes-rendus anatomopathologiques

Pour les principales tumeurs : informations obligatoires à faire figurer sur le compte-rendu ("données minimales" fixées par l'Institut national du Cancer et la société française de pathologie)

• Dont : description histo-pathologique (type histologique, extension, marges de résection, facteurs pronostiques, atteinte ganglionnaire) / stade pTNM..

Archive

• Lames, blocs de tissus inclus conservés au laboratoire sans limite de temps
• Possibilité sur bloc conservé de réaliser secondairement (jusqu'à plusieurs années après):

• Etudes complémentaires à but sanitaire (immuno-histologie, biologie moléculaire… pour thérapeutique ciblée par exemple)
• Travaux de recherche (selon réglementation concernant l'information, la confidentialité et la traçabilité) : réalisation de tumorothèque (permettant la recherche à posteriori de caractéristiques communes à plusieurs cancers..) / possibles aussi sur prélèvements congelés conservés

Information et consentement du patients obligatoires pour conservation & analyse ultérieure / l'anonymat des données est garanti / traçabilité

Double lecture

• Pour les pathologies au diagnostic difficile (tumeurs rares…) : possible nécessité d'un 2e avis de pathologiste sollicité par le pathologiste responsable
• Double lecture systématique pour lymphomes / sarcomes / mésothéliomes / tumeurs neuroendocrines rares mise en place par l'Institut National du Cancer (réseaux de pathologistes)

Examen extemporané

Généralités

Examen anatomopathologiste réalisé le + souvent en cours d'intervention chirurgicale pour fournir un résultat < 30 minutes / toujours complété par examen anatomopathologique définitif

Uniquement utile si incidence sur la conduite de l'acte en cours ++

Applications les + fréquentes

• Déterminer la nature tumorale ou non d'une lésion
• Déterminer la nature bénigne ou maligne d'une tumeur
• Evaluation des limites de résection en cas de pathologie tumorale
• Evaluation de l'atteinte du ganglion sentinelle (cancer du sein)
• S'assurer qu'un prélèvement a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie et a ramené suffisamment de matériel

Techniques

• Prélèvement adressé immédiatement / à l'état frais / sans fixateur ni sérum physiologique
• Examen histologique le plus souvent : sur tissu frais durci par congélation (-20°C) et coupé avec microtome à congélation et coloration rapide de la coupe / résultat obtenu en moins de 30 minutes

• Rarement examen extemporané par cytologie (cytoponctions, liquides…)

Limites de l'examen extemporané

• Résultat temporaire : qualité très inférieure à la coupe après inclusion en paraffine / résultats moins précis et moins fiables / on réalise une vérification systématique par inclusion en paraffine
• La congélation à -20°C abime le tissu / si prélèvement exigu et unique, possible altération irréversible par coloration (& pas de diagnostic ultérieur possible)

• Pas d'examen extemporané possible pour prélèvements calcifiés (coupe impossible)
• Allonge les délais opératoires

Biologie moléculaire non morphologique

Généralités

• Permet recherche de clonalité, perte d'hétérozygotie, mutations, réarrangements..
• Intérêt diagnostique (lymphomes, sarcomes..) / pronostique (amplification de N-Myc dans neuroblastome..) / thérapeutique (mutation d'EGFR dans les adénocarcinomes pulmonaires…)
• Les techniques sont réalisées sur des prélèvements congelés (d'où congélation des fragments tissulaires tumoraux, non fixés, pour tumeur pédiatrique, lymphome, sarcome)
• Possibles également sur prélèvements fixés au formol tamponné (mais l'ADN extrait est alors fragmenté, et l'amplification par PCR peut être + difficile)
• Analyses à réaliser après contrôle morphologique du prélèvement analysé (vérification de la nature tumorale et sa qualité : pourcentage de cellules tumorales, nécrose..)

Techniques

• PCR : amplification génique permettant de repérer un fragment de gène ou d'ADN présent en quantité infime puis de le multiplier rapidement par polymérisation en chaine
• Clonage: introduction fragment d'ADN (gène..) via plasmide dans un organisme unicellulaire / réplication de l'organisme permet d'avoir un grand nombre de copies du gène
• Southern-Blot : recherche de fragment d'ADN sur électrophorèse par hybridation avec sonde complémentaire radioactive
• Northern-Blot : même technique avec de l'ARN
• Puces à ADN : collection de milliers de puits microscopiques avec grand nombre de fragments d'ADN identiques, permettant de mesurer l'expression d'un gène particulier par complémentarité de séquence avec séquence d'ARN correspondant

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• Connaître les principes de réalisation, transmission et utilisation des prélèvements à visée sanitaire et de recherche
• Connaître les modalités de transmission de ces prélèvements au laboratoire d'anatomie et cytologie pathologiques
• Connaître les principes de base de réalisation des techniques morphologiques suivantes : cytologie, histologie, immunohistochimie, hybridation in situ
• Connaître les principes permettant de réaliser des techniques de biologie moléculaire non morphologique sur les prélèvements tissulaires / cellulaires, ainsi que leurs principales indications
• Connaître les principales indications de l'examen extemporané, son principe de réalisation et ses limites
• Connaître les exigences nécessaires pour l'utilisation des prélèvements dans des travaux de recherche

Généralités

Définition

Anatomo-pathologie: étude des lésions provoquées par les pathologies sur les organes, les tissus ou les cellules / elle présente un intérêt diagnostique, pronostique, & d'évaluation d'efficacité des traitement

Examens à toujours corréler avec les données cliniques

Prélèvements

Types: liquide, frottis, produits de ponctions à l'aiguille, biopsies, pièces opératoires

• Cellulaires pour examen cytologique : liquides de ponction / autre liquides (urines, lavage broncho-alvéolaire) / myélogramme / cytoponction / frottis cervico-utérin / apposition sur lame (d'une biopsie ostéo-médullaire..)
• Tissulaires pour examen histologique : biopsies (Numéroter pièces si biopsie multiple : prostate..) / pièce opératoire (dont examen extemporané) / autopsie

Modalités de prélèvement

• Réalisés par médecins selon recommandations et respect des contre-indications
• Quasiment tout tissu prélevé fait l'objet d'un examen anatomopathologique, parfois à titre systématique
• Autres analyses possibles : parasito-mycologie (lavage broncho-alvéolaire..) / biologie moléculaire (fragment de biopsie ganglionnaire)
• Toujours préciser sur le prélèvement le type d'analyse souhaité

Modalités de transmission et d'envoi

Etape essentielle pour bonne réception et bonne qualité de l'analyse

Prélèvement toujours accompagné de demande / chaque prélèvement est identifié, étiqueté, numéroté / si besoin consentement du patient joint pour conservation

Prélèvements adressés avec identification du patient + feuille de demande d'examen anatomopathologique précisant

• Identifiants du patient / adresse du patient et/ou service d'hospitalisation
• Nom du médecin préleveur, coordonnées / caractère urgent éventuel
• Nature du prélèvement / siège du ou des échantillons / date et heure du prélèvement / renseignements cliniques pertinents, aspect macroscopique des lésions / recherches particulières demandées

En général envoyé fixé pour empêcher l'autolyse du tissu (formol dilué)

• Fixation réalisée par l'anatomopathologiste / le prélèvement est envoyé directement congelé sinon
• Sinon envoyer le + rapidement possible pour éviter autolyse/dessiccation
• Indications à ne pas fixer le prélèvement : demande d'examen extemporané / demande de recherche de graisses dans le tissu (car la paraffine dissout les graisses) / demande d'examen d'immunofluorescence directe (biopsie rénale, typage d'amylose…) / tumeur pédiatrique, suspicion de lymphome, sarcome (on réalise la congélation avant la fixation)

Selon le type de prélèvement

• Liquide de ponction : conservation dans un tube sec / transmission tel quel (centrifugé sur lame au laboratoire)
• Etalements (myélogramme..) : étalement sur lame immédiat par préleveur, séchage à l'air, identification de la lame, transmission (plaquettes de protection)
• Frottis cervico-utérin : en phase liquide, cellules conservées en milieu liquide (permet test HPV) / en milieu conventionnel : cellules étalées sur lame d'emblée
• Biopsies : carotte de biopsie fixée par l'alcool pour diagnostic morphologique / formol pour diagnostic morphologique et moléculaire / congelé ou conservé dans RNA-later pour certaines analyses moléculaires (immuno-histochimie, PCR)

Techniques de base en anatomie et cytologie pathologiques

Cytologie

• Fixation/mise sur support (lame) / coloration
• Mise sur support : directement étalées sur lames ou cyto-centrifugation ou étalement (frottis)
• Etalement en monocouche : recueil des cellules sur liquide de préservation / cellules remises en suspension, concentrées et transférées sur lame en une couche
• Fixation : par dessiccation rapide (à l'air) ou par immersion dans alcool ou par pulvérisation d'une laque
• Lames colorées puis examinées / technique très rapide
• Souvent simple orientation diagnostique ou dépistage

Histologie

• Fixation/ éventuelle dissection avec choix des prélèvements pour pièce volumineuse / imprégnation et inclusion en paraffine, obtention du bloc de paraffine / coupe du bloc (microtome) et mise sur lame de la coupe / déparaffinage et coloration de la coupe (hématéine-éosine, …)
• Prend ≈ 1 jour (rajouter 1 jour si dissection à réaliser) / parfois résultats possibles le jour même en cas d'urgence
• Si nécessité d'un résultat en extrême urgence › examen extemporané

Immuno-histochimie / cytochimie (protéines)

• Permettent identification & localisation de protéines sur préparation histologique ou cytologique (via propriétés antigéniques)
• Effectuées sur lames non colorées (après déparaffinage éventuel)
• Formation d'un complexe antigène-anticorps : zone fluorescente si anticorps lié à un fluorochrome ou zone colorée si anticorps lié à une enzyme révélée par une méthode histo-enzymatique
• Immunofluorescence directe : anticorps purifié directement couplé avec molécule de fluorochrome / surtout utilisé pour mise en évidence de dépôts tissulaires d'immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et biopsies rénales congelées (microscope à fluorescence)
• Immunofluorescence indirecte : anticorps primaire révélé par 2e anticorps couplé à une enzyme

Hybridation in situ (ADN-ARN)

• Permet identification de séquence d'acide nucléique (ARN, ADN) dans des cellules d'une préparation histologique ou cytologique
• Sondes nucléiques couplées à traceurs, soit un fluorochrome (FISH) ou soit une enzyme (CISH) (et mêmes méthodes de révélation qu'en immunohistochimie : via microscopie optique pour FISH, coloration pour CISH)

Interprétation des images et comptes-rendus

Lames examinées au microscope par médecin anatomopathologiste (± autres techniques : colorations, immuno-histologie, biologie moléculaire…)

Analyse anatomopathologique selon interprétation d'images, souvent selon le contexte clinique

Terminologie codifiée utilisée dans les comptes-rendus anatomopathologiques

Pour les principales tumeurs : informations obligatoires à faire figurer sur le compte-rendu ("données minimales" fixées par l'Institut national du Cancer et la société française de pathologie)

• Dont : description histo-pathologique (type histologique, extension, marges de résection, facteurs pronostiques, atteinte ganglionnaire) / stade pTNM..

Archive

• Lames, blocs de tissus inclus conservés au laboratoire sans limite de temps
• Possibilité sur bloc conservé de réaliser secondairement (jusqu'à plusieurs années après):

• Etudes complémentaires à but sanitaire (immuno-histologie, biologie moléculaire… pour thérapeutique ciblée par exemple)
• Travaux de recherche (selon réglementation concernant l'information, la confidentialité et la traçabilité) : réalisation de tumorothèque (permettant la recherche à posteriori de caractéristiques communes à plusieurs cancers..) / possibles aussi sur prélèvements congelés conservés

Information et consentement du patients obligatoires pour conservation & analyse ultérieure / l'anonymat des données est garanti / traçabilité

Double lecture

• Pour les pathologies au diagnostic difficile (tumeurs rares…) : possible nécessité d'un 2e avis de pathologiste sollicité par le pathologiste responsable
• Double lecture systématique pour lymphomes / sarcomes / mésothéliomes / tumeurs neuroendocrines rares mise en place par l'Institut National du Cancer (réseaux de pathologistes)

Examen extemporané

Généralités

Examen anatomopathologiste réalisé le + souvent en cours d'intervention chirurgicale pour fournir un résultat < 30 minutes / toujours complété par examen anatomopathologique définitif

Uniquement utile si incidence sur la conduite de l'acte en cours ++

Applications les + fréquentes

• Déterminer la nature tumorale ou non d'une lésion
• Déterminer la nature bénigne ou maligne d'une tumeur
• Evaluation des limites de résection en cas de pathologie tumorale
• Evaluation de l'atteinte du ganglion sentinelle (cancer du sein)
• S'assurer qu'un prélèvement a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie et a ramené suffisamment de matériel

Techniques

• Prélèvement adressé immédiatement / à l'état frais / sans fixateur ni sérum physiologique
• Examen histologique le plus souvent : sur tissu frais durci par congélation (-20°C) et coupé avec microtome à congélation et coloration rapide de la coupe / résultat obtenu en moins de 30 minutes

• Rarement examen extemporané par cytologie (cytoponctions, liquides…)

Limites de l'examen extemporané

• Résultat temporaire : qualité très inférieure à la coupe après inclusion en paraffine / résultats moins précis et moins fiables / on réalise une vérification systématique par inclusion en paraffine
• La congélation à -20°C abime le tissu / si prélèvement exigu et unique, possible altération irréversible par coloration (& pas de diagnostic ultérieur possible)
• Pas d'examen extemporané possible pour prélèvements calcifiés (coupe impossible)
• Allonge les délais opératoires

Biologie moléculaire non morphologique

Généralités

• Permet recherche de clonalité, perte d'hétérozygotie, mutations, réarrangements..
• Intérêt diagnostique (lymphomes, sarcomes..) / pronostique (amplification de N-Myc dans neuroblastome..) / thérapeutique (mutation d'EGFR dans les adénocarcinomes pulmonaires…)
• Les techniques sont réalisées sur des prélèvements congelés (d'où congélation des fragments tissulaires tumoraux, non fixés, pour tumeur pédiatrique, lymphome, sarcome)
• Possibles également sur prélèvements fixés au formol tamponné (mais l'ADN extrait est alors fragmenté, et l'amplification par PCR peut être + difficile)
• Analyses à réaliser après contrôle morphologique du prélèvement analysé (vérification de la nature tumorale et sa qualité : pourcentage de cellules tumorales, nécrose..)

Techniques

• PCR : amplification génique permettant de repérer un fragment de gène ou d'ADN présent en quantité infime puis de le multiplier rapidement par polymérisation en chaine
• Clonage: introduction fragment d'ADN (gène..) via plasmide dans un organisme unicellulaire / réplication de l'organisme permet d'avoir un grand nombre de copies du gène
• Southern-Blot : recherche de fragment d'ADN sur électrophorèse par hybridation avec sonde complémentaire radioactive
• Northern-Blot : même technique avec de l'ARN
• Puces à ADN : collection de milliers de puits microscopiques avec grand nombre de fragments d'ADN identiques, permettant de mesurer l'expression d'un gène particulier par complémentarité de séquence avec séquence d'ARN correspondant